제13장 유전자 조작기술
생물분야에 20세기 후반의 가장큰 업적-->유전자조작기술, 유전자조작기술
제1절 제한효소와 연결효소
1. 제한효소와 그기능
* 세포안에서 DNA분자를 절단하거나 분해하는 효소 nuclease
1) 엔도뉴클레아제(endonuclease): DNA사슬에서 뉴클레오티드를 연결하는 인산에스테
르를 분해하는 엔도뉴클레아제(endonuclease)
2) DNA사슬끝에서 뉴클레오티드를 제거하는 엑소뉴클레아제(exonuclease)
* DNA단편을 연결시키는 효소 ligase(연결효소)
* 제한효소: 대부분이 원핵생물세포에서 발견 DNA의 특정염기서열을 인지 절단
많은 종류의 미생물은 침입한 외래 DNA만을 제한적으로 절단, 분해함.
인지하는 염기서열 6개로 된것이 많지만 4-5개 염기쌍도 인지
2. 제한효소의 종류와 절단 부위
* 효소가 분리된 미생물의 속명의 첫글자와 종명의 2번째까지글자를 합해쓰고 이타릭으로한다.
Escherichia coli, Eco; Haemophilus influenzae, Hin, (Hin dII) d계통에서 발견된 여러종류의
효소는 발견 순서에 따라 I, II, III등으로 표시
* 제한효소에 의한 염기서열의 3가지 절단방법
가. 뭉툭한 말단형성: 인지염기서열 중간부위에서 두가닥 DNA를 동시에 절단
(Bal I, Hae III, Hpa I등)
나. 접착성 말단의 형성: 2개 또는 4개의 염기가 서로 엇갈리게 절단하여 DNA단편 끝에
돌출 부분, 즉 접착성 말단(sticky end)을 형성하는것
1) 5'-PO4 부착성 말단을 형성하거나; 2) 3'-OH 부착성 말단을 형성
3. DNA 연결효소와 그 기능
* 대장균과 T4파지의 DNA 연결효소을 가장 많이 이용.(두가닥의 DNA의 한가닥에 생긴 연결이 끊긴 부분을 연결시켜주고, 두가닥의 DNA단편들을 결합시키거나 동일 DNA분자의 끝을 연결시킨다)
* 접착성 말단은 연결이 쉽다(수소결합에 의해 안정된 염기쌍을 만든다)
* 뭉툭한 말단을 가진 2개의 DNA단편이 접합되는 것은 그 빈도가 상대적으로 낮다.
제2절 재조합 DNA의 작성
재조합된 DNA단편과 이들을 기주세포로 옮길수 있는 유전자 운반체(vector)가 있어야 한다.
1. DNA 단편의 조제
제한효소 이용법과 역전사효소(reverse transcriptase)의 이용법
* 제한효소: DNA를 세포에서 분리 정제한 다음 제한효소로 처리 여러가지 크기의 단편을
만든 후에 전기영동하여 분리기킨다음 겔을 짤라내어 순수DNA 단편을 얻어낸다.
* 역전사효소: mRNA에서 DNA를 합성하는 작용(종양을 일으키는 RNA바이러스 또는 이
바이러스에 감염된 세포에서 발견)
cDNA(complementary DNA): 역전사효소로 합성된 DNA(인트론 부위가 없어서
원핵세포내에서 형질발현이 잘된다)
그림 13-2 참조; oligo dT(소수의 deoxythmidine)에역전사효소첨가
2. 유전자운반체
*DNA vector의 구비조건
1) 운반체 DNA가 기주세포에 쉽게 삽입 될것,
2) 기주세포내에서 증식,
3) 형질전환체를 쉽게 구분 할수있어야 한다.
* plasmid, 박테리아파아지 및 몇가지 바이러스가 운반체로 쓰인다.
* 프라스미드: 박테리아에 널리 분포하고 있는 환상의 작은 DNA로
외피가 없어 다루기 쉽고, 한가지 제한효소 작용 부위가 1개이상,
항생제에 대한 저항유전자를 가지고 있어 쉽게 형질전환체를 찾을수있다.
* 박테리아파지: 세균에 특이적으로 침해, 구조가 간단하고 외투단백질(capsid)의 보호외피
람다와 M13 파아지만 운반체로 사용됨.
* SV40(simian virus 40), CaMv(cauliflower mosaic virus)등이 운반체로 이용됨.
* 표식유전자, 프로모터 및 조절기능을 도입하여 만든 플라스미드 운반체-->pBR 322와 pUC
18/19가 있고 파아지에는 람다 charon 및 M13mp가있다.
3. 재조합 DNA작성
* 그림 13-3. 플라스미드 pBR322의 Pst I부위를 절단한 후 외래 DNA를 끼워 넣는 과정
암피시린과 테트라사이크린 두종류의 항생물질에 대한 저항성유전자를 뜻하며, 재조합되
었을때 암피시린의 저항성이 없어지기 때문에 테트라사이크린이 들어있는 배지에서만 살아
남은 것이 재조합된 박테리아가 된다.
* 단종염기중합말단결합법(homopolymer tailing): 두종류의 DNA을 결합하기위해서는 서로
상보성이 있는 말단을 형성해야 하기때문에 절단된 DNA단편에 말단 연장효소와 함께
dATP를 처리하여 폴리dA를 부착시키고 절단된 운반체DNA에는 말단연장효소와 dTTP를
처리하여 폴리 dA를 부착시키고 절단된 운반체 DNA에는 말단연장효소와 dTTP를
처리하여 폴리 dT말단을 가지게 하여 연결 하는 방법
제3절 유전자 클로닝
1. 기주세포내로 재조합한 DNA도입
대부분의 세균세포에 프라스미드 DNA를 흡수시켜야 함.(자라고 있는 배지로부터 플라스
미드DNA를 흡수할 능력을 가지고있다)
* 대장균(50mM의 염화칼슘을 처리하면 DNA흡수가 잘됨)
* 동물세포는 DNA가 인산칼슘과 함께 세포표면에 침지되면 이를 쉽게 흡수하지만, 진균이나
식물세포는 원형질체와 같이 세포벽을 제거해야만 쉽게 흡수된다.
* micro-injection 법
2. 형질전환세포의 선발
유전자 조작기술의 마지막 단계는 형질 전환 및 재조합체를 선발하는 것이다.
* 형질전환: 살아있는 세포가 외부로 부터 DNA 를 흡수하는 현상.
* 재조합체(recombinant): 형질전환세포중 재조합 DNA를 가진 세포
* 플라스미드의 표식유전자: 형질전환세포 및 재조합체 선발에 가장 많이 사용
(pBR 322의 항생물질저항성)
* 파지: 항생물질 저항성 유전자를 이용 할수 없으나 M13파지의 lac Z+ 또는 람다파지의 cI
유전자부위를 절단하여 외래 DNA를 삽입한 경우에는 정상적인 파지로 구성된 용
균반과는 그색깔이 다르기 때문에 재조합체 선발이 가능하다.
* 핵혼성체검색법(hybridization):
<그림 13-4. DNA-RNA혼성체 형성에 의한 형질 전환 세균의 선발과정>
균군락을 레플리카법으로 찍은후-->DNA이중라선을 풀리게 한후-->방사선동위효소로표
시된 프로브(mRNA)용액에 담근다. 원하는 유전자가 재조합된 균군락에서는
DNA-RNA혼성체가 만들어 지기 때문에 X선 필름으로 확인 할수있다.
* Agrobacterium tumefaciens: 식물 형질전환에 이용한다.
제4절 유전자 조작 기술의 이용
< 1983년 Cohen과 Chang, Boyer & Helling가 각각 시험관에서 기능을 나타내는 재조합 DNA를 만든 이래 유전자조작 기술이 발전함.>
* 희귀약품생산을 포함한 유용단백질의 대량생산, 새로운 백신개발 및 생산, 농작물 품종개량, 고등동물의 유전병치료에 실용적으로 이용 되고 있으며 생명현상을 연구하는 데도 이용되고있다.
1. 유용물질 생산
* 당뇨병치료제인슈린, 인간성장홀몬, 암치료제인 인터페론등이 형질전환된 대장균에서 쉽게
생산
* 미생물 발효공정을 통한 2차대사산물 즉 항생물질, 아미노산, 무공해농약등 신물질
* 폐유분해, 제거능력을 가진 미생물 창출
2. 농작물의 품종개량
* A. tumefaciens의 Ti-plasmid에 의한 형질전환법: Ti-plasmid의 T-DNA부위는 기주식물
체의 핵 DNA에 쉽게 혼입되어 유전적인 형질전환체를 만든다. 따라서 원하는 유전자를
분리하여 Agrobacterium의 T-DNA에 삽입한 후 기주식물의 세포에 도입하는 과정을
거쳐 농작물의 유전적 특성을 개량 할수있다.
* 미세주사법, 원형질체융합법, 전기적 충격법
* 제초제저항성, 내충성, 바이러스저항성 증진 및 광합성효율개선, 단백질 품질향상, 질소고
정능력부여등 연구가 활발히 추진되고있다.
* 식물생장조절, 웅성불임유기, 교잡불화합성 타파
3. 유전병 치료
겸상적혈구 빈혈환자--> 불완전한 베타그로빈유전자를 가지고있어서 정상적인 헤모그로빈을
형성하고 있지 않기때문에 골수세포의 정상적인 베타그로빈유전를
도입시켜 형질발현 을 유도한다면 치료할수있다.
제5절 RFLP에 의한 연관지도 작성
1. RFLP와 형질 전환
* 염기서열이 다르면 제한효소에 의한 절단부위가 달라 절단된 DNA단편의 길이가 차이남.
그림 13-5. 제한효소 Hin dIII로 절단하였을때 두생물의 RFLP
restriction fragment length polymorphism(RFLP): 두개체 사이에 제한효소에 의하여 절단된
DNA단편의 크기에 차이가 나타나는 현상.
(사람의 유전병중 진행성 신경위축병에 대한 표식유전자를 찾는 과정에서 RFLP법개발)
(그림13-6.사람의진행성신경위축병과 연관된 RFLP:4종의 연관 유형중 C형을 가지면 발병됨)
* RFLP를 유전분석에 이용할수있는 특징:
공우성, 표현형에 영향을 주지않는다, 상위작용이없고 , 그수가 많을 뿐만아니라 환경의
영향을 받지않는다
2. RFLP 분석법
* 특정한 DNA단편을 찾기위해서는 프로브를 이용한 DNA-DNA hybridization technique를
적용한다.
* 프로브-->DNA-DNA hybridization을 통하여 상보적인 관계에 있는 외가닥 DNA단편을
찾기위해 사용하는 DNA단편으로 염기서열이 알려져있다.(gene library에서 준비되어야함)
분석하고져하는 생물종으로 부터 분리한 DNA 또는 cDNA를 제한효소로 2-5kb정도로
작게 잘라서이용함.
* 프로브DNA와 게상의 DNA를 외가닥 DNA로 변성 시킨후-->Southern blot법에 의해 겔
상에 있는 DNA단편을 전기영동형태 그대로 멤브레인필터(membrane filter)에 옮긴다.
32P와 같은 방사선 동위효소 처리된 특정 프로브를 이필터에 처리--> 프로브와 상보적인
염기서열 을 가진 DNA가 프로브와 혼성체를 형성--> 형성된 DNA를 autoradiography에
의해 위치확인--> 제한효소에 의해 형성된 DNA단편의 길이를 정확히 알수있다.
3. RFLP 표지유전자를 이용한 연관지도 작성
* 멘델유전법칙에 따라 RFLP유전변이가 나타남.
* 잡종집단 조성-->DNA단편 RFLP에 다형을 나타내는 양친을 선정-->F1, F2 및 역교배
집단 조성-->다형현상이 뚜렷한 프로브와 제한효소 조합 몇개를 선정-->1개의 프로브/
제한효소 조합에 대한 RFLP는 F2에서는 3종류--> 연관분석, 둘이상의 프로브/제한효소
조합에 대한 RFLP가 함께 분리되는 양상을 분석하는 것(동일한 제한효소를 처리하였을때
두종류의 프로브가 연관되어 있다면 F2식물체 각각은 이 두가지 프로브에 대해 동일한
RFLP를 보일것이다).
4. RFLP 의 이용
1) 종류가 다른 생물들의 염색체 유사성비교: 유전자지도 작성, 비교하여 그들간의 유전적
근연성과 염색체 진화에 관한 정보를 얻을수있다.
2) 유전병 진단: 진행성 신경위축병, 근육위축병
3) 동식물의 육종효율증진: RFLP를 이용하여 실용적으로 유용한 유전자의 위치를 정하는
gene tagging에 의해 육종목표 유전자의 직접선발, 조사하는데 시간과 비용이 많이 드는
형질이나 생육후기에 발현되는 형질등을 선발 할때 RFLP을 이용하면 효과적이다.*벼:병
충해 저항성 분석을 RFLP로 대신 할수있게 되었다.
4) 유전자의 분리와 증식: 농업적으로 중요한 형질들은 그 유전자 산물이 밝혀지지 않아서
기존 방법으로는 분리가 어렵다. 그러나 RFLP지도를 이용하면 쉽게 분리할수있다.